A glutation anyagcsere, az enzim szekréció és a szekunder metabolit termelés szabályozásának vizsgálata szénstressznek kitett Aspergillus nidulans tenyészetekben

Regulation of glutathione metabolism, enzyme secretion and secondary metabolite production in Aspergillus nidulans under carbon stress

Gila, Csaba Barnabás

Emri, Tamás

Természettudományi és Technológiai Kar::Biotechnológiai Intézet::Molekuláris Biotechnológiai és Mikrobiológiai Tanszék

2026-02-16T09:04:08Z

2026-02-16T09:04:08Z

2025

2026-03-09

Aspergillus nidulans

CAZyme

glutation-lebontás

mikotoxin-termelés

oxidatív stressz

RNS szekvenálás

szekunder anyagcsere

szénstressz

transzkripciós szabályozás

carbon stress

glutathione degradation

mycotoxin production

oxidative stress

RNA sequencing

secondary metabolism

transcriptional regulation

Kísérleteink középpontjában az Aspergillus nidulans fonalas gomba modell szénstressznek kitett tenyészeteinek RNS-szekvenálással gyűjtött transzkriptom-adatai feldolgozása és értelmezése állt. Ez a megközelítési mód lehetővé tette számunkra, hogy a GSH anyagcserét, a szekunder-metabolitok és CAZyme fehérjék képződését a szénstressz-válasz részeként értelmezzük egy-egy enzim vagy metabolit vizsgálatához képest átfogóbb módon. Korábban az A. nidulans esetében az ún. DUG („deficient in utilization of glutathione”) GSH-lebontó útvonal feltételezett fehérjéinek (DugA, DugB és DugC) funkciója még nem volt tisztázott. Azonban a GSH-metabolizmus megismerése és megértése létfontosságú a mikroorganizmusok redox-szabályozásának megfejtéséhez, valamint gyakorlati szempontból is indokolt, hiszen a gombák nem csak a természetben, hanem ipari alkalmazás során is találkozhatnak olyan körülményekkel (pl. szénstressz), amelyek serkentő hatással lehetnek a nem kívánatos szekunder metabolit-termelésre (mikotoxinok), mely anyagok képződésének visszaszorítására az antioxidáns-kezelést egy ígéretes lehetőségnek tartják. Mindezért kísérleteink első felében a dugB és dugC gének funkcióit vizsgáltuk A. nidulans-ban. A dugB, dugC, vagy azok kettős deléciója a glükózon növekedő micéliumok GSH-tartalmának mérsékelt növekedését, csökkent konídiumtermelést és zavart ivaros fejlődést eredményezett. A transzkriptom adatok kimutatták, hogy a megfigyelésekkel összhangban alulszabályozódtak egyes a differenciációban is fontos MAPK-útvonal gének (pl. steC, sskB és hogA), illetve a konídiumképződést és a szexuális differenciálódást szabályozó fehérjéket (pl. FlbA, NosA, RosA és NsdC) kódoló gének a ΔdugB-ΔdugC mutánsban. A dugB és/vagy a dugC deléciója lassította a GSH-raktárak kimerülését szénéhezés során, emellett csökkentette a ROS-felhalmozódást, az autolitikus sejtfaldegradációt és az enzimszekréciót, de megnövelte az STC-termelést. Transzkriptomikai vizsgálataink alapján feltételezhető, hogy a gomba enzimszekréciója a mikotoxintermeléssel ellentétben poszttranszkripciós szinten szabályozódik. Továbbá azt is megállapítottuk, hogy a GSH alighanem összeköti az éhezést és a redox-szabályozást, hiszen a sejtek a GSH-t raktározott szénforrásként is hasznosítják, ez a GSH-tartalom csökkenése révén redox-egyensúlyvesztést eredményez, ami aktiválhatja a szénstressz válaszért felelős jelátviteli útvonalakat. A gombák genomjában előforduló több száz CAZyme gén összehangolt szabályozásának megismerése szintén nagy gyakorlati jelentőséggel bír. Ezért kísérleteink második felében négy A. nidulans kultúra viselkedését hasonlítottuk össze, amelyeket glükóz, laktóz, vagy arabinogalaktán jelenlétében, illetve szénéhező körülmények között tenyésztettünk. Meghatároztuk a szénstressz-specifikus változásokat (gyenge szénforrás vagy annak hiánya vs. glükóz), és a szénforrás-specifikus változásokat (egyfajta kultúra vs. az összes többi kultúra). Mivel a sejtek szekunder-anyagcseréjét nagymértékben meghatározza a rendelkezésre álló szénforrás minősége és mennyisége, a szekunder-metabolit génklaszterek transzkripciós aktivitását is értékeltük. Számos CAZyme gén mutatott szénstressz-specifikus és/vagy szénforrás-specifikus felülszabályozódást arabinogalaktánon (138 és 62 gén), ahol galaktozidáz és arabinánbontó enzimgének mellett cellulolitikus, pektinolitikus, mannán- és xilánbontó enzimgének transzkripciós aktivitása volt jellemző. Laktózra 81 és 6 (galaktozidázok, xilozidázok és ramnogalakturonázok), szénéhezésre 107 és 16 (ramnogalakturonázok) szénstressz-specifikus, valamint szénforrás-specifikus felülszabályozott CAZyme gént találtunk. Glükózon csak néhány (29 gén) szénforrás-specifikus indukciót mutattunk ki, amelyek jellemzően β-1,4-glükanáz gének voltak. Mind a négy kultúrában volt egy-egy jellegzetes szekunder-metabolit génklaszter, amely a legnagyobb transzkripciós aktivitást mutatta az adott tenyészetnél, de a differenciáltan expresszált klaszterek összességében hasonló mintázatot mutattak. A dolgozatban ezen jellemzők viselkedésökológiai hátterét is értékeltük felhasználva az „enzimatikus felderítés” (secretion of scouting enzymes)”, „adaptív előrejelzés” (adaptive prediction), a „közlegelők tragédiája” (tragedy of the commons) és a „fakultatív csalók” (facultative cheating) modelleket, illetve rendszereztük a CAZyme-termeléssel kapcsolatos ismereteinket, amelyek új stratégiák kidolgozásához vezethetnek a növényi anyagok szacharifikációjához szükséges enzimek előállítására.

Our experiments focused on the processing and interpretation of transcriptome data collected by RNA sequencing of the model filamentous fungus Aspergillus nidulans cultures exposed to carbon stress. This approach allowed us to interpret GSH metabolism, formation of secondary metabolites and CAZyme proteins as part of the carbon-stress-response in a more comprehensive way than the study of a single enzyme or metabolite. Previously, the function of the putative proteins (DugA, DugB and DugC) of the DUG ("deficient in utilization of glutathione") pathway in A. nidulans was not yet clear. However, understanding GSH metabolism is crucial for deciphering the redox regulation of microorganisms. This knowledge is also of practical relevance, as fungi frequently encounter environmental and industrial conditions (e.g., carbon stress) that can induce the production of undesirable secondary metabolites such as mycotoxins. Antioxidant-based interventions represent a promising strategy to mitigate their formation. Therefore, in the first half of our experiments, we investigated the functions of dugB and dugC genes in A. nidulans. Deletion of dugB, dugC, or both resulted in a moderate increase in GSH content of mycelia growing on glucose, reduced conidial production and impaired sexual development. Transcriptome data showed that genes encoding certain MAPK pathway elements (e.g., SteC, SskB and HogA) or proteins regulating conidia formation and sexual differentiation (e.g., FlbA, NosA, RosA and NsdC) were down-regulated in the ΔdugB-ΔdugC mutant, consistent with observations. Deletion of dugB and/or dugC slowed the depletion of GSH pools during carbon starvation, reduced accumulation of ROS, autolytic cell wall degradation and enzyme secretion, while simultaneously increasing STC production. Our transcriptomic results obtain that enzyme secretion by the fungus is regulated at the post-transcriptional level in contrast to mycotoxin production. Furthermore, our results suggest that GSH serves as a molecular link between starvation responses and redox regulation, as cells exploit GSH as a stored carbon source. A decline in GSH levels leads to redox imbalance, which in turn activates signaling pathways associated with carbon starvation stress responses. Understanding the coordinated regulation of the extensive repertoire of CAZyme genes within the fungal genome is also have a great practical importance. Therefore, in the second phase of our study, we compared the behaviour of four A. nidulans cultures grown in the presence of glucose, lactose, or arabinogalactan and under carbon starvation conditions. We determined carbon stress-specific changes (weak or no carbon source vs. glucose) and carbon source-specific changes (one type of culture vs. all other cultures). Since secondary metabolism is largely influenced by the quality and availability of carbon sources, the transcriptional activity of secondary metabolite gene clusters was also assessed. Several CAZyme genes showed carbon stress-specific and/or carbon source-specific up-regulation on arabinogalactan (138 and 62 genes, respectively), where in addition to galactosidase and arabinan-degrading enzyme genes, transcriptional activity of cellulolytic, pectinolytic, mannan- and xylan-degrading enzyme genes was observed. For lactose, 81 and 6 (galactosidases, xylosidases and rhamnogalacturonases) and for coal starvation 107 and 16 (rhamnogalacturonases) carbon stress-specific and carbon source-specific up-regulated CAZyme genes were found. On glucose, only a few genes (29) shown carbon source-specific induction, which were typically β-1,4-glucanase genes. Each of the four cultures was associated a distinct secondary metabolite gene cluster that showed the highest transcriptional activity in that culture, although the differentially expressed clusters showed an overall similar pattern In this thesis, we have also evaluated the behavioural ecology background of these traits ("secretion of scouting enzymes" and "adaptive prediction"), and organized current knowledge on CAZyme production, which may facilitate to the development of novel strategies for optimizing enzyme production for the saccharification of plant materials.

magyar

angol

PhD, doktori értekezés

application/pdf

application/pdf

application/pdf

application/pdf

129

application/pdf

application/pdf

application/pdf

application/pdf

https://hdl.handle.net/2437/404685