A gerjesztő fényintenzitás és az antitest jelölési arányának hatása a kvantitatív fluoreszcenciás mérésekre
The effect of excitation light intensity and the degree of labeling of antibody on the quantitative fluorescent measurements
  • Metaadatok
Tartalom: http://hdl.handle.net/2437/301328
Archívum: DEA PhD
Gyűjtemény: PhD dolgozatok
Molekuláris Orvostudomány Doktori Iskola
Cím:
A gerjesztő fényintenzitás és az antitest jelölési arányának hatása a kvantitatív fluoreszcenciás mérésekre
The effect of excitation light intensity and the degree of labeling of antibody on the quantitative fluorescent measurements
Létrehozó:
Szendi-Szatmári, Tímea
Közreműködő:
Nagy, Péter
Molekuláris orvostudomány doktori iskola
DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
Szatmári, Tímea
Dátum:
2021-01-20T07:37:51Z
2021-01-20T07:37:51Z
2020
2021-02-04
Téma:
antitest
antibody
antitest jelölés
labeling of antibody
jelölési arány
affinity of antibody
fluorofór
antitest affinitás
festék kvantumhatékonyság
quantum efficiency of dye
FRET
FRET hatékonyság
FRET efficiency
fluorofór szaturáció
fluorophore saturation
FRET frusztráció
FRET frustration
mikroszkópia
microscopy
foton-fluxus
photon flux
Elméleti orvostudományok
Orvostudományok
Tartalmi leírás:
A fluoreszcens vizsgálatok, mérések során a minél jobb jel-zaj arány elérése érdekében a két leggyakrabban alkalmazott módszer az antitestek jelölési arányának növelése, illetve a gerjesztési fény intenzitásának fokozása. Ellenben ezek nem kívánatos módon befolyásolják méréseinket, ezzel téves számításokat eredményezve. Kísérleteink során kiderült, hogy az antitestek fluoreszcens festékekkel történő jelölése negatívan befolyásolja az antitestek affinitását és a fluoreszcens festékek kvantumhatékonyságát. A magas jelölési aránnyal rendelkező antitestek alulreprezentáltak lesznek a sejthez kötött frakcióban a csökkent affinitás miatt. Továbbá a fluorofórok között lejátszódó energiatranszfer, illetve kioltásos folyamatok csökkent fényességet fognak eredményezni. Mindezek mellett mikroszkópos mérések során a nagy numerikus apertúrájú objektív fókuszpontjában a megvilágító fény intenzitása olyan nagy, hogy a fluorofórok szaturálódnak. Modellszámításokkal és kísérletes mérésekkel is alátámasztottuk, hogy a hagyományos képlettel számolt FRET hatékonyság nagymértékben csökken a gerjesztő foton-fluxus függvényében. Sikeresen létrehoztunk olyan modelleket, melyek figyelembe veszik a donor szaturációt és a FRET frusztrációt is. Alkalmazásuknak köszönhetően a FRET hatékonyság és annak kiszámolásához szükséges  faktor szinte teljesen függetleníthető a megvilágító lézer intenzitásától. Összefoglalásként elmondható, hogy mindezen mérések, modellek, számítások nagymértékben hozzájárulnak a kvantitatívabb, pontosabb fluoreszcens mérések kivitelezéséhez.
In order to achieve the best possible signal-to-noise ratio during fluorescence measurements, the two most commonly used methods are to increase the labeling ratio of antibodies and to increase the intensity of the excitation light. Nonetheless, they affect our measurements undesirably, resulting in erroneous calculations. In our experiments, it was found that labeling antibodies with fluorescent dyes negatively affects the affinity of the antibodies and the quantum efficiency of the fluorescent dyes. Antibodies with high DOL will be underrepresented in the cell-bound fraction due to their decreased affinity. Furthermore, the energy transfer and quenching processes between the fluorophores will result in reduced brightness. In addition, during microscopic measurements, the intensity of the illumination light at the focal point of a large numerical aperture objective is so high that the fluorophores saturate. With model calculations and experimental measurements we also confirmed that the FRET efficiency calculated by the conventional formula greatly decreases as a function of the excitation photon flux. We have successfully created models that take both donor saturation and FRET frustration into consideration. By applying these equations the dependence on the illumating laser intensity of the FRET efficiency and the  factor required FRET calculations can be almost completely eliminated. In summary, all these measurements, models and calculations significantly contribute to the implementation of more quantitative, accurate and device-independent fluorescence measurements.
Nyelv:
magyar
angol
Típus:
PhD, doktori értekezés
Formátum:
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
120
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
Azonosító: