A PEG10 és ASPRV1 retrovírus-szerű humán aszpartil proteázok biokémiai vizsgálata

Biochemical characterization of the human PEG10 and ASPRV1 retroviral-like aspartic proteases

Golda, Mária

Tőzsér, József

Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola

DE--Általános Orvostudományi Kar -- Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet

2021-06-03T12:54:08Z

2021-06-03T12:54:08Z

2021

2021-06-15

retrovírus-szerű aszpartil proteáz 1 (ASPRV1)

retroviral-like aspartic protease 1 (ASPRV1)

apai allélról expresszálódó gén 10 (peg10)

paternally expressed gene 10 (peg10)

retrovírus-szerű proteáz

retroviral-like protease

Elméleti orvostudományok

Orvostudományok

A Humán Genom Projekt eredménye felhívta a tudomány figyelmét a génállományba integrálódott retroelemek biológiai fontosságára. Munkánk során két, a humán szervezet számára lényeges szereppel bíró retrovírus-szerű aszpartil proteáz vizsgálatával foglalkoztunk. A dolgozatban bemutatjuk az apai allélról kifejeződő gén 10 (paternally expressed gene 10, PEG10) fehérje proteáz doménjének (PRPEG10), valamint a retrovírus-szerű aszpartil proteáz 1 (retroviral-like aspartic protease 1, ASPRV1) fehérjék rekombináns módon történő előállítását és biokémiai sajátságainak vizsgálatát. Munkánk során mindkét enzimfehérje esetében elvégeztük a dimerként funkcionáló fehérjék szerkezeti felépítésének becslését és analízisét szerkezeti bioinformatikai módszerek segítségével, valamint összehasonlítottuk ezen retrovírus-szerű proteázok szekvencia- és szerkezetbeli sajátságait a retrovirális proteázokéval, továbbá az in silico vizsgálatok eredményét felhasználtuk például mutációk tervezéséhez és kísérletes vizsgálatok eredményének értelmezéséhez is. Az expressziós, tisztítási és aktivitás-mérési eljárások optimalizálását követően in vitro módszerekkel vizsgáltuk a vad típusú és irányított mutagenezissel módosított rekombináns enzimek optimális működési körülményeit, poszt-transzlációs módosítások hatását, továbbá az enzimeknek a HIV proteáz inhibitorokkal szembeni érzékenységét. A dolgozatban bemutatott kísérleteinkkel igazoltuk a PRPEG10 intramolekuláris hasítását (autoproteolízis), igazoltuk a fehérje ubikvitinálódását, valamint a PRPEG10 proteáz aktivitásának HEK293T és HaCaT sejtek életképességére és proliferációra gyakorolt hatását. Az ASPRV1 esetében vizsgáltuk az ionerősség és az urea enzim-aktivitásra gyakorolt hatását, meghatároztunk enzimkinetikai paramétereket (KM, kcat, kcat/KM), vizsgáltuk az S2 és S3 szubsztrátkötő zsebek aminosav-preferenciáját és igazoltuk az indinavir, a pepsztatin A és acetil-pepsztatin gátló hatását. Vizsgálataink során bizonyítottuk, hogy az ASPRV1 fehérje auto-proteolízise szükséges az enzim auto-aktivációjához, az auto-proteolízisre való képességet hasítóhely-mutánsok esetében is megvizsgáltuk. A retrovírus-szerű eukarióta homodimer aszpartil proteázok szerkezeti és működési sajátságaira vonatkozó információk korlátozottan állnak rendelkezésre, ezért eredményeink hozzájárulnak a retrovirális és retrovírus-szerű proteázok közötti hasonlóságok és különbségek, valamint a homodimer aszpartil proteázok szerkezet-funkció összefüggéseinek jobb megértéséhez.

The results of the Human Genome Project drew attention to the biological importance of the the retroelements integrated into the genome. During our work we investigated two crucial retroviral-like aspartyl proteases which may play pivotal role in humans. In this dissertation we demonstrate the recombinant production and biochemical characterization of the paternally expressed gene 10 (PEG10) protein’s protease domain (PRPEG10), and the retroviral-like aspartic protease 1 (ASPRV1). In case of both enzymes that function as homodimers, we applied structural bioinformatical methods to estimate and investigate their structures, and we compared the sequences and structural properties of these retroviral-like proteases to those of retroviral proteases, and used the results of in silico analyses e.g. to design mutations and interpret the results of experimental studies. After optimization of the conditions of expression, purification and activity assays, we investigated in vitro the enzymatic features of the wild-type and mutants prepared by site-directed mutagenesis, including the optimal conditions of enzyme activities, the effects of posttranslational modification and the sensitivities of the proteases towards HIV protease inhibitors. With the experiments described in the dissertation, we verified the intramolecular cleavage (autoproteolysis) of PRPEG10, we proved the ubiquitination of the proteins, and the determined the effects of the PRPEG10 activity on the viability and proliferation of HEK293T and HaCaT cells. In case of ASPRV1, the enzyme kinetic parameters (KM, kcat, kcat/KM), as well as the dependence of activity on ionic strength and urea were determined. We determined the amino acid preferences of S2 and S3 substrate binding sites and confirmed the inhibitory potentials of indinavir, pepstatin A, and acetylpepstatin protease inhibitors. We proved that auto-proteolysis of ASPRV1 results in the auto-activation of the enzyme, and the self-processing was studied by investigating auto-proteolytic cleavage site-mutant enzyme forms, as well. The information about the structural and functional characteristics of retroviral-like eukaryotic homodimeric aspartic proteases are still limited, therefore, our results may contribute to a better understanding of the similarities and differences between retroviral and retroviral-like proteases and the structure-function relationships of homodimeric aspartyl proteases.

magyar

angol

PhD, doktori értekezés

application/pdf

application/pdf

application/pdf

application/pdf

114

application/pdf

application/pdf

application/pdf

application/pdf

http://hdl.handle.net/2437/310614