A [gamma]-glutamil transzpeptidáz fiziológiai szerepének vizsgálata az Aspergillus nidulans fonalas gombában

An investigation of the physiological role of [gamma]-glutamyl transpeptidase in the filamentous fungus Aspergillus nidulans

Spitzmüller, Zsolt

Emri, Tamás

Juhász-Nagy Pál doktori iskola

DE--Természettudományi és Technológiai Kar -- Biotechnológiai és Mikrobiológiai Tanszék

2016-10-05T03:40:49Z

2016-10-05T03:40:49Z

2016

2016-06-09

Glutation

[gamma]-glutamil transzpeptidáz

[gamma]-glutamyl transpeptidase

Aspergillus nidulans

Glutathione

Természettudományok

Tervezett vizsgálataink célja az Aspergillus nidulans, mint modell organizmus g-glutamil transzpeptidázának (gGT) jobb megismerése, lehetséges fiziológiai szerepének feltérképezése volt szénéhező tenyészetekben. A ggtA gén deléciója a kimutatási érték alá csökkentette a tenyészetek gGT aktivitását, ami arra utal, hogy - legalább is az általunk vizsgált körülmények között - az AN10444 gén által kódol GgtA az egyetlen olyan fehérje, amely jelentős gGT aktivitással rendelkezett. A tenyészetek relatív ggtA transzkripció és specifikus gGT aktivitás változásai alapján elmondható, hogy a szénéhezés mellett a szénforrás limitáció is indukálta a GgtA termelést. Az indukció mértéke peptidek adagolásával növelhető volt, de csak aktív meaB gén jelenlétében. E tekintetben a GgtA termelés hasonló volt az extracelluláris proteáz termeléshez. A gGT aktivitás nem csak a hifákból, de a fermentléből is jól detektálható volt. Noha a ggtA gén klasszikus szignál szekvenciát nem kódol, az enzim extracelluláris térben való megjelenése - nagy valószínűséggel - aktív szekréciónak és nem a sejtek autolítikus szétesésének volt a következménye. Az extracelluláris térből frakcionált ammónium-szulfátos kicsapás és DEAE-Sephadex anioncserélő kromatográfia segítségével részlegesen kitisztított enzim pH optimuma pH 8,0-nak, hőmérséklet optimuma 45 ºC-nak adódott. Az enzim Michaelis-Menten kinetikát mutatott a gGpNA szubsztrát esetében (Km = 0,2 mM) és aktivitása NaCl jelenlétében nem nőtt, hanem csökkent. A gyengén lúgos pH optimum arra utal, hogy az enzim a szénéhező tenyészetek gyengén lúgos fermentlevében is jól működik. A tisztított enzim jelentős transzpeptidáz, de minimális hidroláz aktivitással rendelkezett. A Gly-Gly mellett a legjobb g-glutamil akceptornak a Glu bizonyult, míg a gGpNA mellett a Gln-t és a GSH-t (kisebb mértékben a GSSG-t) is fel tudta használni, mint g-glutamil donort. A DggtA törzzsel végzett vizsgálatok alapján a GgtA nem szükséges a sejtek GSH tartalmának csökkenéséhez szénstressz alatt. A GSH intracelluláris lebontásáért - feltételezhetően - inkább az elsőként a Saccharomyces cerevisiaeben leírt DUG útvonal lehet felelős. A GgtA és az extracelluláris proteáz termelésben megfigyelt hasonlóságok, a DggtA törzs fenotípusa, valamint a GgtA gyenge hidroláz aktivitása alapján úgy gondoljuk, hogy az enzim elsődleges feladata nem a g-glutamil vegyületek (beleértve a GSH-t és a GSSG-t is) lebontása, hanem ellenkezőleg a g-glutamil vegyületek szintézise lehet. A dolgozatban bemutatott hipotézisünk szerint e g-glutamil vegyületek képződése a szénéhező és szénforrás limitált tenyészetek aminosav és peptid hasznosítását segíthetik elő. E hipotézis alátámasztása azonban még további vizsgálatokat igényel.

We aimed to study the g-glutamyl transpeptidase (gGT) of Aspergillus nidulans as a model organism and elucidate its physiological function in carbon stressed cultures. Deletion of the ggtA gene reduced gGT activity to below the detection limit suggesting that - at least under the conditions we studied - GgtA (encoded by the AN10444 gene) was the only protein which had significant gGT activity. Both carbon starvation and carbon limitation induced gGT production according to the detected changes in the relative transcription of ggtA as well as in the specific gGT activities of cultures. Addition of peptides to the fermentation broth enhanced this induction but only in the presence of active meaB gene. In this respect, GgtA formation was similar to extracellular protease production. gGT activities were detected both from hyphae and from the fermentation broth. Although the ggtA gene does not encode a regular signal sequence, the extracellular occurrence of this enzyme was - most likely - the consequence of active secretion and not passive liberation from autolysing cells. GgtA was partially purified by fractionated ammonium-sulfate precipitation and DEAE-Sephadex anion exchange chromatography. The pH and temperature optima of the enzyme were pH 8.0 and 45 ºC, respectively. It showed Michaelis-Menten kinetics with gGpNA as the substrate (Km = 0,2 mM) and its activity did not increase, but even decreased, in the presence of NaCl. The slightly alkaline pH optimum indicates that the enzyme can be active in the fermentation broth of carbon starved cultures. The partially purified enzyme had significant transpeptidase and negligible hydrolase activity. Besides GlyGly, Glu was the best g-glutamyl acceptor and in addition to gGpNA, Gln and GSH (as well as GSSG to a much lesser extent) functioned as g-glutamyl donors in the GgtA catalyzed reaction. Surprisingly, GgtA was not necessary for the bulk degradation of intracellular GSH under carbon stress according to the phenotype of the DggtA strains. RT-qPCR experiments suggest that instead of GgtA, the orthologues of the Saccharomyces cerevisiae DUG pathway may be responsible for the regulation of intracellular GSH contents. On the basis of the similarities between protease and gGT production, the phenotype of DggtA strain and the weak hydrolase activity of GgtA we assume that the main function of GgtA is not to degrade but synthetize g-glutamyl compounds. This process may help the utilization of peptides and amino-acids in carbon stressed cultures. However, additional experiments are needed to verify this hypothesis.

NE

magyar

angol

PhD, doktori értekezés

application/pdf

application/pdf

119

application/pdf

application/pdf

http://hdl.handle.net/2437/230827