A P-glikoprotein szerkezetének és fehérje interakcióinak vizsgálata keresztkötéses tömegspektrometriával
Cross-linking mass spectrometry on P-glycoprotein
  • Metaadatok
Tartalom: https://hdl.handle.net/2437/364952
Archívum: DEA PhD
Gyűjtemény: PhD dolgozatok
Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola
Cím:
A P-glikoprotein szerkezetének és fehérje interakcióinak vizsgálata keresztkötéses tömegspektrometriával
Cross-linking mass spectrometry on P-glycoprotein
Létrehozó:
Gellén, Gabriella
Közreműködő:
Bacsó, Zsolt
Molekuláris sejt- és immunbiológia doktori iskola
Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar
Gellén, Gabriella
Dátum:
2024-01-11T13:06:41Z
2024-01-11T13:06:41Z
2023
2024-01-26
Téma:
multidrog rezisztencia
keresztkötéses tömegspektrometria
P-glikoprotein
koleszterin
multidrug resistance
cross-linking mass spectrometry
P-glycoprotein
cholesterol
Elméleti orvostudományok
Orvostudományok
Tartalmi leírás:
Az ABC transzporterek családjába tartozó P-glikoproteinről (Pgp) ismert, hogy részt vesz a tumorsejtek multidrog-rezisztenciájában. A koleszterin és egyéb lipidek kulcsfontosságú szerepet játszanak a Pgp konformációinak kialakításában, ennek azonban a hagyományos szerkezetbiológiai technikákkal történő tanulmányozása igen körülményes. Kísérleteink során újszerű, robusztus mintaelőkészítési módszereket alkalmaztunk keresztkötéses tömegspektrometriás (XL-MS) analízishez, lehetővé téve a Pgp szerkezetének vizsgálatát, annak természetes lipidkörnyezete megtartása mellett. Két kísérleti megközelítést alkalmaztunk: (i) az élő sejteket kezeltük keresztkötőkkel, majd membránpreparálást követően dúsítottuk a keresztkötött Pgp komplexeket; (ii) a keresztkötést az immunprecipitációs gyöngyökön végeztük a membránpreparálást és dúsítást követően. A keresztkötött komplexeket extracellulárisan kötődő monoklonális Pgp-ellenes antitestekkel dúsítottuk mágneses gyöngyökön, majd a gyöngyök felszínén történt az enzimatikus emésztés. Az LC-MS/MS eredmények alapján azonosított mono-linkek a Pgp oldószer számára hozzáférhető aminosav-oldalláncait segítettek feltérképezni. A Pgp-n belüli keresztkötések megerősítették a fehérje extracelluláris, transzmembrán és intracelluláris szegmensei közötti kölcsönhatásokat, melyekről ismert, hogy koleszterinérzékenyek. Tömegspektrometriás eredményeinket irodalmi adatokkal és molekuladokkolással kiegészítve meghatároztuk a 15D3 koleszterinfüggő monoklonális antitest epitópját. Emellett az azonosított Pgp fehérjepartnerek bizonyítják a Pgp szoros kapcsolatát a citoszkeletonnal és egyéb koleszterin által szabályozott fehérjékkel. Eredményeink azt sugallják, hogy az XL-MS felhasználható fehérjeszerkezet- és hálózatelemzésekre olyan összetett rendszerekben is, mint a membránfehérjék.
The ABC transporter P-glycoprotein (Pgp) has been found to be involved in multidrug resistance in tumor cells. Lipids and cholesterol have a pivotal role in Pgp’s conformations; however, it is often difficult to investigate it with conventional structural biology techniques. Here, we applied robust approaches coupled with cross-linking mass spectrometry (XL-MS), where the natural lipid environment remains quasi-intact. Two experimental approaches were carried out using different cross-linkers (i) on living cells, followed by membrane preparation and immunoprecipitation enrichment of Pgp, and (ii) on-bead, subsequent to membrane preparation and immunoprecipitation. Pgp-containing complexes were enriched employing extracellular monoclonal anti-Pgp antibodies on magnetic beads, followed by on-bead enzymatic digestion. The LC-MS/MS results revealed mono-links on Pgp’s solvent-accessible residues, while intraprotein cross-links confirmed a complex interplay between extracellular, transmembrane, and intracellular segments of the protein, of which several have been reported to be connected to cholesterol. Harnessing the MS results and those of molecular docking, we suggest an epitope for the 15D3 cholesterol-dependent mouse monoclonal antibody. Additionally, enriched neighbors of Pgp prove the strong connection of Pgp to the cytoskeleton and other cholesterol-regulated proteins. These findings suggest that XL-MS may be utilized for protein structure and network analyses in such convoluted systems as membrane proteins.
Nyelv:
magyar
angol
Típus:
PhD, doktori értekezés
Formátum:
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
89
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
Azonosító: