A Ty1 retrotranszpozon proteáz enzimatikus sajátságainak és humán tripszinek gátolhatóságának vizsgálata

Characterisation of the Ty1 protease and the human trypsins’ inhibitory profile

Gazda, Lívia Diána

Tőzsér, József

Molekuláris Sejt- és Immunbiológia Doktori Iskola

Debreceni Egyetem::Általános Orvostudományi Kar

2023-05-30T11:52:03Z

2023-05-30T11:52:03Z

2023

2023-06-15

proteáz

tripszin

retrovírus

protease

trypsin

retrovirus

Elméleti orvostudományok

Orvostudományok

Tanulmányaim során két proteáz és azok inhibitorainak tanulmányozására nyílt lehetőségem. Az S. cerevisiae Ty1 retrotranszpozon-eredetű Ty1 proteáz His6 címkével jelölt és natív jelöletlen formáit BL21(DE3) E. coli baktérium törzsben termeltettük. A proteáz jellemzőit, biokémiai sajátosságait elsőként vizsgáltuk. A Ty1 proteáz legfontosabb sajátságai nagymértékben hasonlóak a retrovírus és retrovírus-szerű proteázokéhoz. Megállapítottuk a proteáz kinetikai paramétereit (KM, kcat, kcat/KM) különböző természetes hasítóhelyeket reprezentáló szubsztrátokra. Módosított szubsztrátokkal arra kerestük a választ, hogy a Ty1 proteáz esetében létezhet-e a korábban HIV-1 proteáz esetén azonosított felszíni szubsztrát kötő rész, azonban eredményeik alapján ez a Ty1 proteáz esetében nincs jelen. Vizsgáltuk az ionerősség, hőmérséklet, pH és urea koncentráció hatását az enzim aktivitására, az eredmények mind összehasonlíthatóak voltak a retrovírus-szerű proteázokra jellemző értékekkel. Továbbá vizsgáltuk a HIV1 proteáz és egyéb általános aszpartil proteáz gátlószerek hatását a Ty1 proteázra. Méréseink alapján, a proteáz természetes rezisztenciával rendelkezik a legtöbb HIV- 1 proteáz inhibitorral szemben. Munkánk során a vad típusú, illetve hét betegben azonosított SPINK1 variáns (N34S, N37S, K41N, I42M, P55S R65Q és Q68R) gátlási képességét vizsgáltuk szulfatált és nem- szulfatált humán tripszin izoformákon. A vad típusú és a mutáns SPINK1 fehérje változatok hatását a kötéserősségre az asszociációs és disszociációs állandók megállapításával vizsgáltuk. Amikor a vad típusú SPINK1 kötődését vizsgáltuk E. coli-ban termelt (nem-szulfatált) és hasnyálból tisztított tripszin (szulfatált) esetében, a kationos tripszin esetében 50-szeres, az anionos tripszin esetében több mint 120-szeres csökkenést mértünk a KD értékekben. Megvizsgáltuk a nem-szulfatált és szulfatált humán kationos tripszin átmeneti gátlását a vad típusú és a szakirodalomban hasnyálmirigy-gyulladással asszociált N34S SPINK1 variánssal. Nem figyeltünk meg jelentős eltérést a kötéserősségben vagy degradációban. Vizsgáltuk továbbá a SPINK1 fehérjében két mesterséges mutáció (Y43A és Y43R) hatását a szulfatált és nem-szulfatált kationos tripszin Y154-nel való kölcsönhatásra. A kötés erősségét a tripszinek szulfatációs állapota határozta meg, gyengítve vagy erősítve azt. Mindent összevetve, eredményeink arra engednek következtetni, hogy a SPINK1 inhibitor gyengébb kötődése a tripszin izoformákhoz elhanyagolható, nem kiváltó oka a hasnyálmirigy gyulladásnak, a betegség kialakulásához inkább az inhibitor csökkent expressziója és/vagy megváltozott foldingja járulhat hozzá.

During my studies I had the opportunity to study two proteases, their properties and their inhibition. We expressed and purified the protease from the S. cerevisiae Ty1 retrotransposon. We characterised the His-tagged and untagged form of the Ty1 protease using HPLC and fluorometric enzyme activity assay methods. The biochemical properties of the protease are similar to the retroviral and retroviral like proteases. We have measured and calculated the kinetic parameters of the protease (KM, kcat, kcat/KM) on artificial oligopeptides and fluorophore fused protein substrates mimicking natural cleavage sites. An extended surface binding site of HIV1 protease has been discovered recently, therefore with modified substrates we were studying the putative surface substrate binding grooves of Ty1 protease. We have not found proof of the presence of surface substrate binding sites. We have studied the effect of ionic strength, temperature, pH and urea concentration on the enzyme activity, the properties of Ty1 protease were comparable to the properties of other retroviral and retroviral-like proteases. Finally, we have performed studies with HIV1 and other aspartic protease inhibitors. Based on our results the Ty1 protease is naturally resistant against most of the HIV-1 inhibitors. We have also studied the inhibitory potential of seven SPINK1 variants (N34S, N37S, K41N, I42M, P55S, R65Q, and Q68R) on sulphated and non-sulphated human trypsin isoforms. We determined the association and dissociation rate constants and calculated the equilibrium dissociation constant for the wild-type and mutant SPINK1 variants. We measured the KD of the wild type SPINK1 with the recombinant (non-sulphated), and native (sulphated) human cationic and anionic trypsins. In the case of cationic trypsin we observed a 50-fold increase, whilst for the anionic trypsin we measured more than 120-fold increase of the KD values. We studied the temporary inhibition of the sulphated and non-sulphated forms of human cationic trypsin by N34S SPINK1 and found no significant difference between the mutant and the wild type of the inhibitor. Moreover, we have studied the effect of two artificial mutations (Y43A and Y43R) and their interaction with the Y154 residue of sulphated and non- sulphated cationic trypsin. The inhibitory effect was dependent on the sulphation of the trypsin isoforms. Altogether, we suggest that the SPINK1 mutations do not affect the inhibitory potential significantly, and that the SPINK1 mutations probably contribute to the development of pancreatitis through the impaired expression of the gene and/or by the reduced folding and secretion of the inhibitor.

magyar

PhD, doktori értekezés

application/pdf

application/pdf

application/pdf

application/pdf

115

application/pdf

application/pdf

application/pdf

application/pdf

https://hdl.handle.net/2437/354414